Sirkulerende tumor-DNA: Kommer snart til en patolog nær deg

Av Even Holth Rustad, PhD-stipendiat ved Institutt for klinisk og molekylær medisin, NTNU, og Research Fellow, ­Myeloma Service, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

---

Fritt DNA i blodet har gitt oss non-invasiv fosterdiagnostikk og er på full fart inn i onkologien. Er ”flytende biopsier” bare noe forskerne har det gøy med, eller en ny biomarkør som må tas på alvor?

Når kreftceller dør, slipper de ut DNA. Små mengder av dette ender opp i pasientens blod og kan isoleres fra plasma eller serum¹. Genetiske analyser av slikt sirkulerende tumor-DNA (ctDNA) kan identifisere genetiske avvik i selve kreftsvulsten, fra punktmutasjoner til strukturelle variasjoner på kromosomnivå. En utfordring er at konsentrasjonen av ctDNA er veldig lav: ofte vil kun 0.01-1 % av den totale mengden sirkulerende DNA komme fra svulsten (størsteparten av sirkulerende DNA kommer fra normale blodceller). Dette stiller store krav til sensitive analysemetoder, som først ble utviklet tidlig på 2000-tallet. Siden det har feltet vokst raskt, og i dag er ctDNA på vei inn i klinisk praksis. Samtidig gjenstår viktig arbeid for å definere hvordan ctDNA kan brukes for å gi best mulig pasientbehandling. I denne klinisk rettede oversikten skal vi se nærmere på tre bruksområder for ctDNA: (1) ”flytende biopsier” (liquid biopsies) til molekylærgenetisk diagnostikk;  (2) evaluering av behandlingsrespons; og (3) kreftscreening.

Flytende biopsier

Informasjon om genetiske endringer i kreftcellene blir i økende grad relevant for diagnostikk og kliniske beslutninger. Et aktuelt eksempel er påvisning av EGFR-mutasjoner ved avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Dette er klinisk relevant for valg av EGFR-inhibitorer, men hos mange av disse pasientene er det vanskelig å få tak i en biopsi for mutasjonstesting. Derfor har flere kliniske studier av EGFR-inhibitorer inkludert mutasjonsstatus i ctDNA som endepunkt. Resultatene viser ingen forskjell i progresjonsfri overlevelse der EGFR mutasjonen er påvist i biopsi sammenliknet med ctDNA³. Dette til tross for at det ikke er 100 % samsvar mellom mutasjonsstatus i ctDNA og biopsi; sannsynligvis har begge metodene falskt negative resultater. For ctDNA kan falske negative svar forekomme når konsentrasjonen er for lav, av årsaker som ikke har noe med genetikk å gjøre. Konsentrasjonen av ctDNA er interessant i seg selv, men mer om dette senere. For tumorbiopsier kan ulike metastatiske lesjoner hos samme pasient ha forskjellig genetisk avvik; det kan til og med være forskjeller i ulike deler av samme tumor. Her er det fortsatt mye vi ikke helt forstår. Poenget er uansett at ctDNA og tumorbiopsier viser seg å være tilsvarende med hensyn til kliniske endepunkter. Derfor er EGFR-testing av ctDNA godkjent som klinisk test i både USA og Europa. Selv om vi enda ikke er der at ctDNA kan erstatte vanlige biopsier, kan det være et godt alternativ der det er vanskelig å få tak i biopsimateriale.

Dessverre er resistensutvikling nærmest uunngåelig ved mutasjonsspesifikk behandling. Ofte er resistensmekanismen en ny mutasjon, og flere studier har vist at man kan oppdage slike mutasjoner i ctDNA før resistens manifesterer seg klinisk. For eksempel kan man hos pasienter med metastatisk tykktarmskreft som får EGFR-inhibitor oppdage i ctDNA at en KRAS mutasjon dukker opp og fører til progresjon⁶. Ved sekvensering av ctDNA kan man også lete etter helt nye resistensmutasjoner, enten i hele det kodende genomet eller i et mindre antall gener⁷.

Det store potensialet for flytende biopsier ligger i muligheten for å ta mange prøver over tid, for å følge utviklingen i kreftsvulsten. På den måten kan man tilpasse behandlingen fortløpende til kreftsvulstens utvikling. I dag er det PCR-metoder for enkeltmutasjoner som er enklest å innføre, men nyere metoder basert på DNA-sekvensering blir stadig mer sensitive samtidig som prisen går ned. Med sekvensering av mange gener kan man undersøke kreftsvulstens klonale evolusjon over tid, og se hvordan endringene relaterer til fenotype og behandling. Et slikt sekvenseringspanel for ctDNA er under implementering for klinisk bruk ved Memorial Sloan Kettering Cancer Center i New York, der jeg for tiden er på forskningsopphold.

Evaluering av respons på behandling.

Er pasienten kurert av kirurgi – eller trenger pasienten adjuvant kjemoterapi? Denne typen spørsmål har vi hele tiden i onkologien, og ctDNA kan gjøre oss mer treffsikre. Målbart ctDNA etter forsøk på kurativ behandling identifiserer en gruppe som nesten uten unntak vil få tilbakefall. Tie og medarbeidere viste dette klart for tykktarmskreft med intermediær risiko (stadium 2), i en prospektiv kohort med 230 pasienter⁸. Alle ble operert med kurativ intensjon, og 52 fikk adjuvant kjemoterapi. Av pasientene som ikke fikk kjemoterapi, hadde 14 påviselig ctDNA postoperativt, og 11 (78.6 %) av disse hadde fått tilbakefall etter median oppfølgingstid på 27 måneder. Blant 164 pasienter med negativ postoperativ ctDNA, fikk 16 tilbakefall (9.8 %). Forskjellen i risiko for tilbakefall var slående, med 18 i hazard ratio (95 % CI 7.9-40). Til sammenlikning hadde den konvensjonelle biomarkøren carcinoembryonalt antigen (CEA) ingen signifikant prognostisk effekt. Tre pasienter med positiv ctDNA hadde enda ikke fått tilbakefall innenfor studiens oppfølgingstid.

Pasientene som fikk adjuvant kjemoterapi ble analysert separat, og i denne gruppen var det 6 pasienter som hadde positiv ctDNA etter kirurgi, før adjuvant behandling. Gjentatte målinger av ctDNA samsvarte godt med klinikken hos fire pasienter: To ble først ctDNA negative under behandling, før ctDNA steg igjen og begge utviklet tilbakefall, mens to ble vedvarende ctDNA negative og fortsatt uten tegn til tilbakefall etter 16 og 34 måneder. Den femte pasienten utviklet tilbakefall til tross for at ctDNA var vedvarende negativ, mens den sjette var uten tilbakefall etter 34 måneder til tross for lavgradig fluktuerende ctDNA. Dette illustrerer styrkene til ctDNA, men også det vi enda ikke forstår. For klinisk anvendelse er det av stor betydning at en situasjon med ctDNA-positivitet og høy risko for tilbakefall kan snus til ctDNA-negativitet og langvarig overlevelse ved hjelp av adjuvant behandling. Samtidig var det totalt fire pasienter i denne studien som ikke fikk tilbakefall til tross for positiv ctDNA (en i adjuvant-gruppen, tre som bare ble operert). Kort oppfølgingstid er en sannsynlig forklaring, og det er velkjent at tilbakefall kan komme lenge etter tilsynelatende kurativ behandling. Alternativt kan resultatene skyldes en cellepopulasjon som likner genetisk på den opprinnelige kreftsvulsten, men som ikke gir klinisk sykdom. Fremtidige studier vil gi svar på dette.

For å forstå hvordan konsentrasjonen av ctDNA reflekterer kreftsykdommen i ulike faser fra diagnose til død, gjorde vår forskningsgruppe i Trondheim en studie av pasienter med myelomatose⁹. Myelomatose egner seg godt til å utforske egenskapene til ctDNA, fordi vi allerede har en god biomarkør for sykdomsbyrde (M komponent: monoklonalt immunoglobulin produsert av maligne plasmaceller). Vi fulgte 11 pasienter med sekvensielle serumprøver i inntil 7 år, og fant imponerende samsvar med M komponent hos 10 av 11 pasienter (se Figur 1 for funnene hos én av pasientene). Det var også viktige forskjeller mellom de to biomarkørene. Hos noen pasienter fulgte ctDNA sykdomsaktiviteten tettere enn M komponent, gjennom å falle raskere ved behandlingsrespons og stige tidligere ved tilbakefall. For responsevaluering er halveringstid viktig, og den er ca. 140 minutter for ctDNA mot 2-3 uker for komplett immunglobulin. Dette er vist elegant ved at ctDNA faller til 0 allerede dager etter radikal kirurgi¹⁰. Utover i sykdomsforløpet skjedde det også noe interessant med forholdet mellom ctDNA og M-komponent. Mens konsentrasjonen av ctDNA ble høyere for hvert tilbakefall, var M komponenten hos de fleste enten lavere eller på samme nivå som ved forrige tilbakefall (Figur 1). Hos tre pasienter som transformerte til en svært aggressiv fenotype mot slutten av forløpet, så vi eksponentiell økning i ctDNA. Dette gir viktig informasjon, både om M komponent og ctDNA. Som mange andre proteinmarkører er M komponent noe som cellen aktivt produserer og skiller ut. Det avhenger av et visst funksjonsnivå. Ettersom den maligne fenotypen utvikler seg, går slike modne funksjoner tapt, mens cellene deler seg raskere og det er økt celledød. Ved slik avansert sykdom vil konsentrasjonen av M komponent underestimere tumormassen, mens ctDNA øker mer enn det tumormasse alene skulle tilsi.

Før ctDNA virkelig kan ”ta av” som biomarkør for tumormasse i klinisk bruk, trenger vi flere studier der ctDNA brukes til å styre behandling av pasienter. For eksempel kan man se for seg noe tilsvarende dagens praksis ved akutt lymfatisk leukemi, der måling av ”minimal residual disease” i beinmargen brukes til å styre behandlingsintensitet. Pasienter som i utgangspunktet har lav risiko, men fortsatt er ctDNA-positive etter første behandlingslinje, kan randomiseres til enten mer behandling eller standard oppfølging. Her er det mye spennende forskning som kan gjøres ved så godt som alle kreftsykdommer.

Screening

Tidlig kreftdiagnostikk gjennom screening er en enkel ide med stor potensiell nytte. Dessverre er det ikke så enkelt i praksis, og en viktig årsak er at testene vi har til rådighet er for lite spesifikke til å brukes i en frisk befolkning. Som potensiell screeningtest er ctDNA svært spesifikt, men sensitiviteten er lav for små svulster. Dessuten kan ctDNA i prinsippet komme fra hvilket som helst organ. En måte å kompensere for dette er å kombinere ctDNA med kjente proteinmarkører, som Cohen og kolleger nylig publiserte i Science¹¹. Screeningtesten, som de kaller ”CancerSEEK”, leter etter vanlige kreftmutasjoner i 16 gener, og måler i tillegg 8 proteinmarkører. Median sensitivitet var 70 % for lokaliserte svulster i syv ulike organer, hos 1005 pasienter (ovarie, lever, magesekk, bukspyttkjertel, spiserør, tykk-og endetarm, lunge og bryst). Sensitiviteten var høyest for ovarie (98 %) og lavest ved brystkreft (30 %). Svulsten kunne lokaliseres i rett organ hos over halvparten av pasientene, inkludert 84 % med tykk- og endetarmskreft, og 81 % med kreft i bukspyttkjertelen. Som negativ kontroll testet de 812 friske frivillige, hvor testen var positiv hos 7 personer. Det er ikke sikkert at alle disse var falske positive; det kan også skyldes tidlig oppdagelse av ikke-erkjent kreft. Et konservativt estimat der alle regnes som falskt positive, gir en spesifisitet på 99 %. Forfatterne anslår at metoden kan skaleres opp til en kostnad under 500 amerikanske dollar per test.

CancerSEEK-studien er spesielt viktig fordi den viser at flere kreftsykdommer kan påvises med en enkelt blodprøve. De ulike elementene av testen kan endres over tid, for å dekke andre sykdommer eller forbedre testegenskapene ettersom man oppdager nye biomarkører. Det er likevel utfordringer med studien, først og fremst at kreftpasientene allerede hadde fått diagnosen. Sensitiviteten i en reell screeningsituasjon vil derfor være lavere enn rapportert her.

Fremtiden for ctDNA

Det unike med ctDNA er at mange ulik aspekter ved kreftsykdommen kan fanges med en enkelt blodprøve; fra genetiske endringer til tumormasse. Informasjonen er spesifikk for kreftsvulsten og kan følges over tid. Dette vil gi ny innsikt i kreftsykdommers molekylære evolusjon og mekanismer for resistens mot behandling. For umiddelbar klinisk nytte har jeg stor tro på bruk av ctDNA for å evaluere respons på behandling, og her er det bare å designe kliniske studier. For selve ctDNA-analysen er det flere forskningsgrupper i Norge som bygger infrastruktur for dette. For screening har forskningen så vidt begynt, og vi i Norge er i en unik situasjon til å bidra med populasjonsbaserte studier. Når det gjelder spørsmålet jeg begynte med i ingressen, burde det nå være klart hvor gøy ctDNA er for forskere. Jeg tror derimot ikke det stopper der; ikke i dag, og definitivt ikke i fremtiden.

---

Referanser

1. Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nat Rev Cancer. 2017;17(4):223-238.
2. Normanno N, Denis MG, Thress KS, Ratcliffe M, Reck M. Guide to detecting epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in ctDNA of patients with advanced non-small-cell lung cancer. Oncotarget. 2017;8(7):12501-12516.
3. Douillard JY, Ostoros G, Cobo M, et al. Gefitinib treatment in EGFR mutated caucasian NSCLC: circulating-free tumor DNA as a surrogate for determination of EGFR status. J Thorac Oncol. 2014;9(9):1345-1353.
4. Thierry AR, Mouliere F, El Messaoudi S, et al. Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA. Nat Med. 2014;20(4):430-435.
5. Sanmamed MF, Fernandez-Landazuri S, Rodriguez C, et al. Quantitative cell-free circulating BRAFV600E mutation analysis by use of droplet digital PCR in the follow-up of patients with melanoma being treated with BRAF inhibitors. Clin Chem. 2015;61(1):297-304.
6. Diaz LA, Jr., Williams RT, Wu J, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 2012;486(7404):537-540.
7. Murtaza M, Dawson SJ, Tsui DW, et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 2013;497(7447):108-112.
8. Tie J, Wang Y, Tomasetti C, et al. Circulating tumor DNA analysis detects minimal residual disease and predicts recurrence in patients with stage II colon cancer. Sci Transl Med. 2016;8(346):346ra392.
9. Rustad EH, Coward E, Skytoen ER, et al. Monitoring multiple myeloma by quantification of recurrent mutations in serum. Haematologica. 2017;102(7):1266-1272.
10. To EW, Chan KC, Leung SF, et al. Rapid clearance of plasma Epstein-Barr virus DNA after surgical treatment of nasopharyngeal carcinoma. Clin Cancer Res. 2003;9(9):3254-3259.
11. Cohen JD, Li L, Wang Y, et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science. 2018.