Genanalyser av kreftsvulster – Hvem? Hva? Hvordan?

Patologenes vurdering av svulstvevet er en svært viktig brikke i utredning og oppfølging av kreftpasienter, og faget har gjennom de siste tiårene i økende grad integrert morfologi (dvs. makro- og mikroskopisk undersøkelse) med informasjon fremskaffet ved molekylære analyser. Først ute var elektronmikroskopi, tett etterfulgt av immunhistokjemiske teknikker og fluorescensundersøkelser. Parallelt begynte man å se behovet for å påvise ytterligere DNA- og RNA-endringer slik som mutasjoner, translokasjoner, lengdevariasjon og kopitall, noe som krevde ekstraksjon av nukleinsyrer (DNA/RNA) fra svulstvevet. For mange sykehus ble det da etablert molekylærpatologi-laboratorier som en egen enhet i patologiavdelingen. Det har vært hensiktsmessig å ha laboratoriene tett knyttet til patologene da det sammenfaller med den naturlige sub-spesialisering som skjer i patologifaget der man må tilpasser både hvilke analyser som bør bestilles, hastegrad og tolkning av de ulike funn utfra kunnskap om de ulike krefttypene. Alt dette anses nødvendig for å kunne tilby klinikerne komplett diagnostisk svar som integrerer morfologisk vurdering med alle tilleggsundersøkelser. En viktig erkjennelse har vært at molekylære endringer kan ha ulik klinisk betydning avhengig av tumortype og klinisk situasjon, det er derfor naturlig at den molekylære diagnostikken av svulster er integrert i patologifaget som også tradisjonelt har en tett interaksjon også med de ulike kliniske kreftmiljøene.

---

HEGE G. RUSSNES, Overlege og leder, seksjon for utprøvende diagnostikk og forskningsstøtte, Klinikk for laboratoriemedisin, Oslo Universitetssykehus. Leder av Norsk Forening for Molekylær Patologi. Leder av Nasjonalt kompetansenettverk for persontilpasset medisin.

ULLA RANDEN, Overlege og leder, avd. for patologi, Akershus universitetssykehus. Leder av Den Norske Patologforening.

---

FRA DNA TIL RNA TIL PROTEIN

Et av de mest sentrale dogmene innen molekylær biologi er at DNA koder for RNA- fragmentene som igjen «oversettes» til protein. Det funksjonelle nivået her er proteinene, og immunhistokjemiske (IHC) analyser visualiserer spesifikke proteiner og gjør at man kan vurdere både mengde protein og også hvilke celletyper og hvor i cellene det er uttrykt. Det å visualisere spesifikke proteiner i vevssnitt gir et bredere fenotypisk inntrykk av svulsten og styrker vurderingen av for eksempel differensieringsnivå og -retning, noe som igjen er grunnleggende for klassifisering av kreft. For noen krefttyper er IHC helt nødvendig for å stille diagnosen, for andre typer benyttes det for å påvise fravær eller tilstedeværelse av et protein som kan ha direkte behandlingskonsekvens.

Noen typer molekylære endringer kan ikke identifiseres ved proteinanalyser og man må da gjøre DNA- eller RNA-baserte analyser. De tidlige eksemplene på klinisk nytteverdi er BRC-ABL translokasjon (ved kronisk myelogen leukemi), EGFR mutasjoner ved adenokarsinomer i lunge og KRAS mutasjoner ved tykktarmskreft 1.

FREMVEKSTEN AV MOLEKYLÆRPATOLOGI

I mange år har patologiavdelingene utført et mindre utvalg av DNA- og RNA-analyser og bare for visse indikasjoner/krefttyper, men i løpet av det siste tiåret har dette endret seg betydelig. De største laboratoriene tilbyr nå mer enn 50 ulike molekylære analyser. Først og fremst så har forskning vist at mange krefttyper har undergrupper med molekylære trekk som bør regnes som separate entiteter 2. Slik ser man i større grad også konturene av en molekylær klassifisering av kreftsvulster og mange av disse entitetene får i økende grad egne behandlings- og oppfølgningsforløp. For blod- og benmargskreft er molekylære analyser helt nødvendig for diagnostikk (ofte en kompleks kombinasjon av flowcytometri, IHC, DNA- og RNA-analyser i tillegg til morfologisk vurdering). Et annet eksempel på nylig endring er innen brystkreft hvor molekylær testing ble inkludert i handlingsprogrammet for hormonreseptor-positiv brystkreft i 2019. Her vil en undersøkelse av genuttrykket på RNA-nivå i 50 gener både gi en molekylær sub-klassifisering og også en risikoscore for sannsynlighet for tilbakefall av kreftsykdommen.

De fleste molekylære analyser som er anbefalt for solide svulster er innført pga. introduksjon av behandlingskonsepter hvor molekylær endring i svulsten har behandlingsmessig (prediktiv) betydning. Ved slike analyser vil molekylær undersøkelse av svulstvevet kunne si noe om sannsynlighet for terapirespons og for noen krefttyper brukes dette også for å vurdere resistensutvikling. I tillegg ser man at nye behandlingsprinsipper i økende grad er basert på molekylære endringer i svulstene, dette gjør at kliniske studier i økende grad utføres på undergrupper av pasienter. Noen behandlingsprinsipp går på tvers av tumortyper og dette, kombinert med at slike forandringer ofte er lavfrekvente, gjør at det nå er et behov for mye bredere gentesting i form av store genpaneler hos mange pasienter. I slike paneler undersøkes langt flere gener enn man har gjort så langt innen molekylærpatologien.

«Molekylære endringer har ulik klinisk betydning ut ifra tumortype og klinisk situasjon»

GENTESTING AV SVULSTER – EN SELVFØLGELIGHET I MODERNE KREFTPATOLOGI

Molekylære analyser er nå en selvfølgelighet i patologifaget 3, men lysmikroskopisk undersøkelse er fortsatt en viktig hjørnesten, nettopp fordi klinisk betydning av de tumorklassene man gjenkjenner ved fenotype (histologi inkludert IHC) er basis for internasjonale klassifiseringer (både WHO og UICC) og nasjonale retningslinjer. Ettersom molekylære analyser inntil nylig har handlet om enkelt-gen analyser (og som oftest bare en liten del av et gen) er laboratoriene bygget opp med ulike spekter av teknologi, instrumenter og kompetanse for å håndtere dette varierte behovet. Det har ofte vært nødvendig å tilpasse både vevsbehandling og analysemetode for hver enkelt gentest. Metodene som har vært benyttet er mange men hovedprinsipper har vær Sanger sekvensering og ulike kvantitative PCR teknikker. Repertoaret av vevsprosesseringsmetoder er stort og reflekterer det vide spekteret av celle- og vevsprøver patologiavdelingene mottar; DNA og RNA skal kunne hentes ut (ekstraheres) fra formalinfikserte operasjonspreparater men også fra grovnåls- og finnålsbiopsier, benbiopsier, ferskfrosset vev og fra ulike kroppsvæsker (blod, spinalvæske, urin, bukhinnevæske etc.). Vevs(celle) mengden varierer betydelig og kan være helt ned til små millimeterstore gryn (få celler), og det kan i tillegg være svært ulike andel med tumorceller i de ulike vev eller celleprøver som skal undersøkes. Fikseringsmetoder og fikseringstid påvirker DNA- og RNA- kvalitet; optimal fiksering for lysmikroskopisk og IHC-undersøkelse er ikke alltid gunstig for krevende DNA-/RNA- analyser, og metodevalget for analysene må ta hensyn til dette. Behovet for både å analysere flere gener og at dette skal gjøres ved flere indikasjoner har gitt en stor økning av prøvemengden for laboratoriene. I tillegg er det uhensiktsmessig å ha mange ulike analyseoppsett; det er kostbart og krevende at dette skal vedlikeholdes, krever ulike instrumenter og ulik kompetanse, og tidsbruk per prøve blir høy. Dette, kombinert med at mange prøver ikke har nok DNA eller RNA til å få utført flere analyser, har gjort det veldig nødvendig å kunne samkjøre flere analyser for flere indikasjoner. Neste generasjons sekvensering (NGS) teknologi muliggjør sekvensering av flere millioner biter DNA eller RNA samtidig, og representerte er paradigmeskifte for to tiår siden som har medført en enorm kunnskapssøkning omkring bl.a. gen-forandringer og kreft. Det er utviklet ulike plattformer og analysetester som benytter NGS prinsippet, men som er tilpasset diagnostiske behov; det vil si at man kan håndtere varierende type prøvemateriale, DNA/RNA kvalitet og at hastigheten på analysene og tolkning av svarene samsvarer med klinisk behov, se enkel fremstilling i Figur 1.

GENPANEL-TESTING I NORGE

Det å få etablert genpanel-testing for kreft var allerede i 2018 en del av tilleggsoppdraget fra helseminister Høie til helseforetakene, men en nasjonal plan for implementering har ikke foreligget. Det er i hovedsak to ulike teknologiske plattformer for genpanel-testing; IonTorrent (fra Thermo Fisher) og Illumina (se Metzker 2010 for en grundig oversiktsartikkel 4). Hovedprinsippene for begge er at man fragmenterer DNA (eller RNA) og bitene forbehandles og får «pålimt» spesifikke endestykker. Man kaller DNA- bitene for prøvens «bibliotek». Dette sendes inn i sekvenseringsmaskinen som etter en PCR-amplifisering av bitene «leser av» nukleinsyre-rekken for hver eneste DNA-bit som var i prøven. Hvor mange biter fra hvert område som leses er avgjørende for hvor sikkert man kan fastslå om det er en endring der; dette kalles lesedybde. Deretter vil man ved hjelp av bioinformatisk dataanalyse identifisere hvor i genomet hver bit hører hjemme, telle dem og identifisere eventuelle feil i nukleinsyre-rekken. Dermed kan man påvise mange typer avvik ved å sammenligne med «normal» prøve (enten en standard prøve eller pasientens egen kimbane), og avvikene som kun finnes i svulstcellene betegnes som de somatiske mutasjonene.

For diagnostikk er det enn så lenge både dyrt og tidkrevende å analysere hele genomet, derfor gjør man en selektiv analyse av en gruppe gener; genpanel-analyser. Det finnes en rekke ulike sammensetninger/genpaneler, og det kan benyttes ulike metoder for å «hente ut» bare aktuelle gen-områder fra en kreftprøve. For å hente ut gen-områder kan man enten trekke ut de genbitene man er interessert i (ved hybridiseringsteknikker) eller å forsterke dem ved amplifisering (PCR- baserte teknikker) i forkant av at man «limer» på endestykkene; man får dermed en betydelig mindre mengde bibliotek som maskinene skal lese. Ved i tillegg å lime på en spesifikk nukleotidrekke på bibliotekene fra ulike pasienter (kalles barkode) kan man blande sammen prøver fra mange pasienter, analysere dem samtidig og sortere dem fra hverandre først under databehandlingen. Lesedybde er spesielt viktig for kreftprøver ettersom man alltid har en andel normale celler som «fortynner» fragmenter med mutasjon; jo mer DNA/bibliotek man sender inn i maskinen, jo dypere leses det, og dette øker sensitiviteten til analysen. Ved kreftprøver er det en fordel å ha mer enn 100 ganger lesedybde av gen-områdene i panelet. Dette tar av analysekapasiteten til instrumentet og er således også en god grunn til å velge genpaneler som primært vil analysere de mest aktuelle genforandringene med sikker klinisk betydning.

NGS OG KOSTNADER

Kostnader ved NGS-analyser har endret seg dramatisk, og nå begynner prisen for å analysere et lite genpanel (f.eks. 15 gener) på de enkleste NGS-instrumentene å ha samme kostnad som en analyse av kun noen få områder i enkelt-gener ved tradisjonell PCR basert teknologi. Dette er gitt at man har tilgang til kompetanse, tilpasset instrument og IT infrastruktur. Når man tar i bruk noe større gen-paneler så vil kostnader til slike analyser også øke. Dette skyldes noe mer behov for teknisk personale i laboratoriet (mer krevende å etablere biblioteket), personaltid for tyngre dataanalyser og tolkning av resultater, reagenser til genpanelene/bibliotekoppsett, dyrere prøveinnsatser i NGS instrumentet (såkalte flowceller/chip’er), samt data kapasitet (regnekraft og lagring). I tillegg har man instrumentkostnader (instrumentpris og serviceavtale). Selv om det er to hovedleverandører levererer de et spekter av instrumenter hvor noen er egnet for små laboratorier (kan utføre små gen-paneler/få prøver) til andre som kan analysere hele genomet fra flere hundre prøver samtidig. Spesielt ser man at det er kostnadsbesparende å ha tilpasset utstyr; store maskiner har flowceller som er svært dyre og man må passe på å ha nok prøver som kan samkjøres ellers blir pris per prøve ekstremt høy.

SAMHANDLING OG INFRASTRUKTUR

Det har stort sett vært opp til hvert enkelt helseforetak når, hvem, hva og hvordan man har tatt i bruk NGS-teknologien i molekylærpatologi. Stavanger universitetssjukehus og Universitetssykehuset Nord-Norge var de to første i Norge som etablert NGS i kreftdiagnostikken; henholdsvis IonTorrent (Thermo Fischer) og Illumina plattformene. Begge miljøene har vært generøse og delt sine erfaringer med andre helseforetak, og i dag er NGS etablert ved de fleste større patologiavdelinger.

Det er nå to større initiativer for å styrke samhandling mellom miljøene i Norge med mål om å standardisere og harmonisere tilbudet samt øke hastigheten innen metodeetablering og mulighet for bredere genpanel-testing av kreftpasienter i Norge; det «Nasjonale kompetansenettverket for persontilpasset medisin» og «Infrastruktur for presisjonsdiagnostikk».

Det Nasjonale kompetansenettverket for persontilpasset medisin i Norge er under etablering på oppdrag fra Helse- og Omsorgsdepartementet og beskrevet i Nasjonal strategi for persontilpasset medisin i helsetjenesten 2017-2021. For å styrke interaksjon og samhandling slik at man lettere kan utveksle f.eks. kompetanse, protokoller og kontrollprøver har kompetansenettverket begynt et arbeid med å kartlegge NGS analyser i kreftdiagnostikk ved de ulike helseforetakene i Norge. Dette arbeidet ledes av patolog Anne Pernille Harlem Dyrbekk (Sentralsykehuset i Vestfold) og har som mål å få etablert et nasjonalt undernettverk for å øke interaksjoner mellom ansatte som jobber innenfor feltet. Som eksempel ser man at det er ulike genpaneler som er etablert og det er også svært utfordrende for mindre sykehus å etablere teknologien uten å få dedikert støtte fra større foretak, og slike ansvarsforhold er ikke tilstede nå.

INTERAKSJON MED TRANSLASJONELL FORSKNING

I tillegg ser vi at feltet endrer seg svært raskt; både på kunnskapssiden (bl.a. genforandringer, deres betydning og behandlingsmuligheter) og også den teknologiske og bioinformatiske siden. Det er helt nødvendig å ha tett interaksjon mellom ikke bare patologi, molekylærbiologi, bioinformatikk og klinikk men også tett tilknytning til translasjonelle og kliniske forskningsmiljø. I 2019 valgte Helse Sør-Øst regionalt helseforetak (HSØ RHF) å foreta tildeling av både strategiske forskningsmidler og å øremerke noe regional kjernefasilitetsstøtte for å bygge opp «infrastruktur for presisjonsdiagnostikk» (InPreD) for kreft ved Oslo Universitetssykehus (OUS) med samarbeid inn mot Akershus universitetssykehus (Ahus). Dette var i tråd med erfaringen man hadde fått etter etablering og utføring av utvidet genpanel- testing ved bl.a. MetAction studien 5, hvor man ved både OUS og Ahus så hvor utfordrende det er å bygge opp og drifte infrastruktur for studiediagnostikk (som ikke er del av rutinetilbudet til laboratoriene) 6. Ved OUS er det derfor i 2020 etablert en ny seksjon ved avdeling for patologi; Seksjon for utprøvende diagnostikk og forskningsstøtte. Formålet er å bistå med diagnostikk særskilt for kliniske studier innen kreft og sørge for å få på plass teknologi, kompetanse og logistikk for utprøvende fase av både ny diagnostikk og behandling. Seksjonen koordinerer InPreD OUS, som nå etablerer utvidet gen-panel- testing

«Integrert kreftdiagnostikk krever tett dialog med klinisk miljø»

(500 kreftrelaterte gener samt enkelte RNA fusjoner, for formalinfiksert vev) som vil være egnet til bruk i kliniske studier som krever bred molekylær testing. I tildelingen fra HSØ RHF til OUS ble det spesifisert at InPreD skal være regional og nasjonal pådriver for etablering av tilsvarende infrastrukturer, og det er nå tatt initiativ for å få dannet et nasjonalt nettverk med InPreD strukturer ved alle universitetssykehusene i Norge. Dersom dette realiseres vil man styrke muligheten for forsker-initierte studier som behøver molekylær testing men også for at flere internasjonale kliniske studier vil involvere norske miljø fordi man enklere kan få testet og identifisert mulige studiepasienter. Ved at slike miljø ligger tett knyttet til patologiavdelinger vil man forvente raskere kompetanseoverføring fra frontlinje forskning til diagnostikk og klinisk bruk. Parallelt arbeider InPreD med å klargjøre forholdene omkring takst og refusjonsordninger for denne type virksomhet.

«Både kompetansenettverket og infrastruktursatsningen skal sikre at norske kreftpasienter får tilgang til lik diagnostikk og behandling uavhengig av bosted»

MODERNE KREFTPATOLOGI ER INTEGRERT VURDERING AV MORFOLOGI OG SPESIALANALYSER

Både kompetansenettverket og infrastruktursatsningen er tiltak som skal både sikre bedre standardisering, harmonisering og kompetanseoverføring, og som skal sikre at norske kreftpasienter får tilgang til lik diagnostikk og behandling uavhengig av bosted. Det skal også bidra til at molekylærpatologi ved små, mellomstore og store laboratorier velger fornuftige og sikre løsninger for genpanel-analyser ved å styrke samarbeidet og ved å ta ansvar for kompetansebygging på tvers av helseforetak og regioner. Molekylærpatologi er i økende grad en selvfølgelig del av patologvurderingen av kreftsvulster og er essensielt for å velge den mest optimale metoden og sikre rett tolkning av molekylære endringer 3, et godt eksempel er de europeiske retningslinjene for deteksjon av NTRK fusjoner 7. Det er viktig å erkjenne at man ikke kan forstå svulstens fenotype ved DNA analyser; man er fortsatt avhengig av morfologisk og immunhistokjemisk undersøkelse for å klassifisere svulsten. I tillegg er f.eks. lokal immunrespons av betydning for behandlingsvalg for flere svulsttyper; dette krever egne diagnostiske tilnærminger. Og ikke minst; dersom prøven ikke inneholder nok tumorceller eller ved stor grad av heterogenitet i tumor kan vevsbiopsi være fra «feil» område og et prøvesvar fra gen-analyser som ikke er integrert med mikroskopisk vurderingen av samme prøvebit kan gi svært uheldige konsekvenser.

Integrert kreftdiagnostikk krever også tett dialog med klinisk miljø 8, og dette gjenspeiles ved økende behov for multidisiplinære møter ved alle sykehus og selv små patologiavdelinger utfører nå enkelte molekylære tester for å kunne sammenholde hele det diagnostiske bildet. Mindre genpanel-analyser utført på plattform med integrert data tolkning kan være hensiktsmessig for mange avdelinger uavhengig av størrelse, men de større panelene krever tyngre instrumentering og tettere tilknytning til kompetansemiljø man finner ved universitetssykehusene. I tillegg er volum en faktor som må tas med i betraktning, både på grunn av kostnader men også for å bygge nok erfaring. Patologimiljøene kjenner godt «voksesmertene» dette molekylære paradigmeskiftet medfører 9 . Både Den Norske Patologforening og Norsk Forening for Molekylærpatologi arbeider for at helseforetakene får kontinuerlig oppgradering av teknologi og genpanel-analyser når det er hensiktsmessig, og at dette inkluderer at onkologiske miljøer og norske pasienter også øker mulighetene for utprøvende diagnostikk og behandling.

Takk til Olav Karsten Vintermyr for konstruktive innspill.

 

Referanser:

1. Harris, T. J. R. & McCormick, F. The molecular pathology of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology 7, 251–265 (2010).
2. Hoadley, K. A. et al. Cell-of-Origin Patterns Dominate the Molecular Classification of 10,000 Tumors from 33 Types of Cancer. Cell 173, 291–304.e6 (2018).
3. Matias-Guiu, X. et al. The leading role of pathology in assessing the somatic molecular alterations of cancer: Position Paper of the European Society of Pathology. Virchows Arch. 476, 491–497 (2020).
4. Metzker, M. L. Sequencing technologies – the next generation. Nat. Rev. Genet. 11, 31–46 (2010).
5. Ree, A. H. et al. Molecularly matched therapy in the context of sensitivity, resistance, and safety; patient outcomes in end-stage cancer – the MetAction study. Acta Oncol 30, 1–8 (2020).
6. Ree, A. H. et al. Implementing precision cancer medicine in the public health services of Norway: the diagnostic infrastructure and a cost estimate. ESMO Open 2, e000158 (2017).
7. Marchiò, C. et al. ESMO recommendations on the standard methods to detect NTRK fusions in daily practice and clinical research. Ann. Oncol. 30, 1417–1427 (2019).
8. Salto-Tellez, M., James, J. A. & Hamilton, P. W. Molecular pathology – the value of an integrative approach. Molecular Oncology 8, 1163–1168 (2014).
9. Nass, S. J. et al. Improving Cancer Diagnosis and Care: Patient Access to High-Quality Oncologic Pathology. Oncologist 24, 1287–1290 (2019).