Genetisk heterogenitet i levermetastaser frå colorectalcancer

Inger Marie Løes disputerte 12.04.16 for PhD graden ved Universitetet i Bergen med avhandlinga ”Genetic heterogeneity in liver metastases from colorectal cancer”. Løes er spesialist i onkologi frå 2010, og har i perioden 2011-2015 vore stipendiat ved Klinisk institutt 2, UiB. Ho er no overlege ved Avdeling for kreftbehandling og medisinsk fysikk, Haukeland universitetssjukehus.

---

Doktorgradsarbeidet er utført ved Mohn kreftforskningslaboratorium under rettleiing av professor Per Eystein Lønning, professor Halfdan Sørbye og seniorforskar Stian Knappskog.

Bakgrunn

Onkologisk behandling har blitt svært kompleks, og mange pasientar gjennomgår multimodal behandling beståande av ulike kombinasjonar av kirurgi, kjemoterapi og strålebehandling. Ved enkelte diagnosar kjem endokrin behandling, behandling med monoklonale antistoff eller immunterapi i tillegg.

Ulike kreftdiagnosar og ulike pasientar treng sjølvsagt ulik behandling, så tanken om å tilpasse behandlinga til den enkelte pasient er ikkje ny. Men med dei målretta behandlingane, som vert gitt basert på molekylære endringar i kreftsvulstane, har det dukka opp nye aspekt å ta omsyn til. Dersom ein skal planlegge behandlinga til ein pasient ut frå endringane ein finn i ein biopsi, er det sjølvsagt viktig at ein  tar prøve av rett svulst, at biopsien er representativ for heile sjukdomen  ein skal behandle og at analysemetoden har tilstrekkeleg sensitivitet og spesifisitet. Ei av dei store utfordringane for moderne målretta behandling er difor ulike nivå av tumorheterogenitet.

Mål med prosjektet

Vi ønska å lære meir om colorectalcancerbiologi gjennom å studere grad av genetisk heterogenitet mellom metastasar frå ein og same pasient og mellom pasientar. Vidare ville vi undersøke om det finnast biologiske markørar som kan predikere kva pasientar som har mest nytte av kirurgi i metastatisk setting.

Pasientmateriale

Ettersom kirurgisk behandling med kurativ intensjon fortsatt er mogeleg for pasientar med metastatisk colorectalcancer, så lenge alle sjukdomsmanifestasjonar er resektable, framstod colorectalcancer som ein god modell for å kunne undersøke intra-individuell eller inter-tumor heterogenitet (Figur 1). Vi kunne hauste både ferskfrosse og formalinfikserte vevsprøver frå alle metastasane frå same pasient utan at dei måtte gjennomgå ekstra prøvetaking utover ei blodprøve. Såleis kunne vi sjå på om det var skilnad mellom metastasane innad i ein pasient, altså intra-individuell heterogenitet og også graden av slik heterogenitet.

I perioden frå august 2006 til mars 2013 samla vi i samarbeid med gastrokirurgisk avdeling, Haukeland Universitetssjukehus inn vevsprøver frå 422 levermetastasar frå 164 pasientar med metastatisk colorectalcancer i ei pågåande prospektiv studie. Det vart og tatt korresponderande blodprøver frå alle pasientane. Både pasientar med metakrone og synkrone metastasar vart inkluderte, og omlag halvparten av pasientane hadde fått kjemoterapi før operasjonen. Meir detaljerte pasientkarakteristika går fram av Tabell 1.

Resultat

Avhandlinga vart basert på resultat frå fire manuskript. I samband med at vi undersøkte dei ulike metastasane for ulike mutasjonar, samanlikna vi også tre ulike metodar som er i bruk for påvising av den aktiverande mutasjonen V600E i genet BRAF inkludert Sanger sekvensering, ei smeltepunkts analyse (Light Mix) og immunhistokjemi (IHC) med det mutasjonsspesifikke antistoffet VE1. Alle metodane vart prøvd ut i vev frå både malingt melanom og frå colorectalcancer (1).

Vi analyserte gDNA frå 127 metastaser frå maligne melanom frå 77 pasientar og 389 svulstar frå 141 colorectalcanverpasientar (383 levermetatsaser og 6 primærsvulstar) ved Sanger sekvensering og ved LightMix. FFPE vev frå ei undergruppe av desse lesjonane (hhv n=77 og 304) vart analyserte ved IHC ved det V600E-spesifikke antistoffet VE1.

I ei fortynningsrekke av T1799A (V600E)-mutert DNA i villtype DNA, var deteksjonsgrensa for smeltepunktsanalysa 1:1000 muterte allel, mens den var 1:10 for Sanger sekvensering. I tråd med dette fann vi i dei kliniske prøvene 15 ekstra melanomprøver med mutasjon og to ekstra metastaser blant colorectalprøvene med mutasjon ved LightMix samanlikna med funn gjort ved Sanger sekvensering.

For melanomprøvene observerte vi stor grad av samsvar mellom dei DNA-baserte metodane og IHC, men i colorectalmetastasane derimot var IHCresultata dårlege. 12 prøver vart scora som V600E positive kun ved IHC, og ni prøver vart scora som V600E negative kun ved IHC (Figur 2a og 2b). På bakgrunn av dette kan vi ikkje anbefale VE1antistoffet for klinisk bruk i colorectalcancerprøver. I melanom kan imidlertid IHC eventuelt nyttast som screeningverktøy for å guide vidare analyser.

I den neste studien såg vi på mutasjons-frekvens i KRAS, BRAF, PIK3CA og TP53 i kirurgisk fjerna levermetatsaser samt deira innverknad på prognose etter leverreseksjon (2). Mutasjonsstatus vart undersøkt i alle dei ulike metastasane i kvar pasient slik at vi også kunne avgjere graden av intra-individuell heterogenitet.

422 metastaser frå164 pasientar var tilgjengeleg for analyse. Mutasjons-frekvensen for dei analyserte gena var KRAS (33.5%), BRAF (6.1%), PIK3CA (13.4%), og TP53 (60.4%). Heterogene resultat mellom metastasane frå same pasient vart observert i hhv. 10, 1, 5 og 9 pasientar, for KRAS, BRAF, PIK3CA og TP53. I alt var det 13 (10 %) av pasientane som hadde heterogene mutasjonsresultat for ein eller fleire av dei undersøkte mutasjonane
(Figur 3).

Både KRAS og BRAF mutasjonar var signifikant assosiert med redusert tid til tilbakefall (TTR) (p < 0.001 and p = 0.002) og sjukdomsspesifikk overleving (DSS)
(p = 0.001 and p < 0.008) etter lever-reseksjon i univariat analyser. Mutasjonar i PIK3CA var signifikant assosiert med kortare TTR (p = 0.023), men ikkje med DSS. TP53 mutasjonar såg imidlertid ikkje ut til å påverke resultatet etter leverkirurgi.

Blant 94 pasientar med to eller fleire metatsasar, observerte vi heterogene mutasjonsfunn for eitt eller fleire gen hos 13 (10%). Mutasjonsheterogenitet indikerte betydeleg redusert median DSS samanlikna med homogene mutasjonar (18 vs 37 mnd; p = 0.011).

Denne studien viser at KRAS og BRAF mutasjonar i tumorvevet har negativ innverknad på overleving etter leverreseksjon for metatstisk colorectalcancer. Den indikerer og at heterogenitet kan vere ein viktig prediktiv markør for resultatet av levermetastasekirurgi per se. Postoperativ kjemoterapi etter leverreseksjon derimot, viste seg i dette materialet å vere ein viktig faktor for betra overleving på tvers av alle pasientgruppene.

Gjennom samarbeid med professor Ragnhild Lothe sin lab ved seksjon for molekylæronkologi, institutt for, Oslo Universitets sjukehus, har vi vidare kunne sjå på grad av genetisk heterogenitet ved hjelp av høgoppløyselege heilgenom kopitalsanalysar (SNP6). Heile 134 metastasar frå 45 colorectalcancerpasientar med to eller fleire metastasar har blitt analyserte (3). Detaljerte resultat frå dette arbeidet må imidlertid avvente publikasjonen.

I det siste arbeidet undersøkte vi om BRAF over-uttrykking kunne ha same effekt som aktiverande BRAFmutasjonar på overleving i colorectalcancer (4). Vi analyserte den prognostiske verdien av BRAF mRNA ekspresjonsnivå i 386 lever metastaser frå 164 pasientar med metastatisk colorectalcancer som gjennomgjekk leverreseksjon. Men også dette er foreløpig upubliserte data slik at nærare skildring av resultata må vente.

Kort resymert påviste vi ulike mutasjonar i dei ulike metastasane (intra-individuell heterogenitet) hos vel 10% av pasientane (Figur 3). Vi såg at pasientar med stor grad av intra-individuell heterogenitet, i likhet med pasientar der vi fann spesifikke mutasjonar i gena KRAS eller BRAF, hadde større risiko for tilbakefall etter leverreseksjon. På den andre sida hadde dei som fekk postoperativ kjemoterapi etter leverkirurgi mindre risiko for tilbakefall og betre sjanse for kurasjon. Mutasjonsanalyse ved hjelp av IHC med VE1 gav både falske negative og falske positive resultat, spesielt ved bruk i vev frå colorectalcancer, og kan såleis ikkje brukast i diagnostikken hos desse pasientane (Figur 2a og b).

Konklusjon

Nivået av genetisk intra-individuell heterogenitet varierer mellom pasientane, og representerer ein av faktorane som påverkar prognosen etter leverreseksjonar i tillegg til mutasjonar i KRAS og BRAF. Ein må også vurdere nøye både kva tumor ein tar prøve frå og kva analysemetode ein nyttar for å detektere molekylære markørar som påverkar behandlingsval.

Originalartiklar:

1. Løes, I.M., Immervoll, H., Angelsen, J.H., Horn, A., Geisler, J., Busch, C., Lønning P.E., Knappskog S. (2015). Performance comparison of three BRAF V600E detection methods in malignant melanoma and colorectal cancer specimens. Tumour Biol 36, 1003-1013.
2. Løes I.M., Immervoll H., Sørbye H., Angelsen J.H., Horn A., Knappskog S. Lønning P.E.: Impact of KRAS, BRAF, PIK3CA, TP53 status and intraindividual mutation heterogeneity on outcome after liver resection for colorectal cancer metastases. International Journal of Cancer (2016).
3. Sveen A.*, Løes I.M.*, Alagaratnam, S., Nilsen G., Høland M., Lingjærde O.C., Sørbye H., Graue Berg K.C., Horn A., Angelsen J.H., Knappskog S., Lønning P.E.#, Lothe R.A.#: High intra-individual genetic heterogeneity in metastatic colorectal cancer predicts patient prognosis after liver resection. (In revision; PLoS Genet)  *Shared first authorship  #Shared senior authorship.
4. Løes I.M., Birkeland E., Immervoll H., Sørbye H., Angelsen J.H., Horn A., Lønning P.E., Knappskog S.: BRAF expression in liver metastases from colorectal cancer predicts time to relapse after liver surgery. (Manuscript in preparation).